畢赤酵母中的表達實驗

一、培養基和微生物操作技術

在 實 驗 室 水 平 培 養 畢 赤 酵 母 菌 及 其 他 大 部 分 酵 母 菌 的 技 術 與 培 養 大 腸 桿 菌 和 釀 酒 酵母 菌 類 似 。最 常 用 的 豐 富 培 養 基 是 Y P D [ 1 % 酵 母 提 取 物（yeast extrac0 、2 % 蛋 白 胨(peptone) 、2 % 葡 萄 糖（dextrose) ] 培 養 基 ，最 常 用 的 確 定 成 分 培 養 基 是 Y N B 培 養 基0. 6 7 % 的 含 硫 酸 銨 不 含 氨 基 酸 的 酵 母 氮 源（yeast nitrogen base) 、2 % 葡 萄 糖 、50 p g / m L的 任 何 生 長 必 需 的 氨 基 酸 和 核 苷 酸 ]。必 赤 酵 母 利 用 甲 醇 生 長 時 需 要 將 培 養 基 中 的 葡 萄 糖替 換 成 0 . 5 % 的 甲 醇 。交 配 /產 孢 (mating/spomlation) 培 養 基 由 0 . 5 % 乙 酸 鈉 、1 % 氯 化 鉀 、1 % 葡 萄 糖 組 成 。培 養 基 中 加 入 2 % 瓊 脂 后 可 以 制 成 培 養 平 板 (Petri plate)。培 養 通 常 在30°C 進 行 。在 Y P D 液 體 培 養 基 中 ，畢 赤 酵 母 的 代 時 大 約 是 90 m i n ; 在 確 定 成 分 的 培 養 基 中代 時 大 約 是 3 h 。如 果 甲 醇 作 為 唯 一 碳 源 ，那 么 在 確 定 成 分 培 養 基 中 的 代 時 大 約 是 5 h 。

二、遺傳株的構建

盡管畢 赤 酵 母 有 多 種 類 型 的 標 志 物 (marker)，但 滿 足 研 究 人 員 的 目 標 標 志 物 組 合 可能 并 不 存 在 。因 此 ，構 建 一 套 具 有 最 理 想 標 志 物 的 宿 主 菌 是 很 有 必 要 的 。構 建 菌 株 的 第— 步是 交 配 并 篩 選 二 倍 體 (diploid)(Tolstorukov and Cregg, 2008)。 因 為 畢 赤 酵 母 在 功能 上 是 同 宗 結 合 的 (homothallic), 且 同 株 的 細 胞 間 也 會 發 生 交 配 ，因 此 在 計 劃 進 行 交 配 時不 用 考 慮 菌 株 的 交 配 型 。但 是 , 畢 赤 酵 母 間 的 交 配 效 率 較 低 ，因 此 進 行 交 配 的 菌 株 具 有 互補的標記是非常必要的，這些標記能夠允許雜交產生的二倍體選擇性生長但抑制自身交配產生的二倍體和親代株的生長。營養缺陷（auxotrophic) 標記在使用時最為便利。但是能夠影響生長或其他表型的基因突變，如影響對甲醇或某種氮源（甲胺) 利用的基因突變也是很好的標記。下面是畢赤酵母交配的操作步驟。

1. 交 配 ，生成二倍體

(1)首先 從 Y P D 平板上挑取待交配菌株的新鮮克隆 (不要超過 1 周），然 后 在 另 外 2塊 Y P D 平板上分別劃出多條平行的菌線。

(2) 30°C 培養過夜，將 2 塊劃線平板上的酵母菌轉移到 1 塊無菌的絲絨布上, 此時，要 使 2 塊平板上的菌線互相垂直。

(3) 將絲絨布上互相交叉的菌線轉移到交配/孢子生成平板上，室 溫 下 培 養 2?3 天后開始交配。

(4) 在培養后，將交配/孢子生成平板上的酵母菌影印復制到另一個含有合適培養基
的瓊脂平板上篩選互補的二倍體。二倍體克隆會在 30°C 孵 育 2?3 天后長在劃線的交叉處 。畢赤酵母二倍體的大小大約是單倍體的 2 倍 ，通過光學顯微鏡可以依據孢子的大小和較高的孢子生成效率來辨識。

(5) 在二倍體選擇培養基上通過劃菌線的方法得到二倍體的單克隆。

(6) 在缺少氮源的情況下，畢赤酵母二倍體能高效地進行減數分裂并生成孢子。為
了使二倍體進入這種生命狀態，用平板影印法或用接種環直接將新鮮二倍體克隆 (生長在添加有葡萄糖的 Y P D 平板上) 轉移到交配/孢子生成平板; 在室溫培養 3?4 天 。所有生成孢子的畢赤酵母在孢子囊中會聚集紅色色素，因此生成孢子褐色的二倍體可以很容易地與相對白色的單倍體區別開來。還可以通過普通顯微鏡或相差顯微鏡觀察培養中出現的大量子囊 (a s d) 來辨識出二倍體。

2. 隨機孢子分析

畢赤酵母孢子很小且彼此黏在一起。這使得通過顯微操作技術分離四分孢子（ tetrad dissection) 變得很難。因此，獲得的孢子需要進行隨機孢子分析 ( r a n d o m spore analysis，R S A )，過程如下所述。

( 1 ) 用接種環將畢赤酵母孢子 (來自上一過程第 6 步) 轉移到裝有 0. 25 m L 無菌水的I.5 m L 離心管中，渦旋振蕩混勻。

(2) 在通風櫥中向孢子樣品中加人 0. 25 m L 二乙醚 (diethyl ether), 室溫徹底禍旋振蕩 大 約 5 m i n 。用乙醚處理可以選擇性的殺死存留在孢子中的營養體。

(3) 仍然在通風櫥中，離 心 2 m i n ，吸出上層的乙醚，用下層的水重懸孢子沉淀。取出10 uL 或 I O O uL 重懸液涂布到非選擇 Y P D 平板。

(4) 30°C 培養 4?5 天 ，挑取單克隆在新鮮 Y P D 平板上劃線，作為進一步分析用的主平板（master plate)。

(5) 將主平板上的菌落影印復制到含有合適分析培養基的一系列平板上?；蛘? 直
接影印復制最初的平板上的 1 〇〇 ?600 個克隆。例 如 ，h 1 S4 菌 株 和 arg4 菌株交配后獲得的孢子可以在添加有葡萄糖的 Y N B 培養基中進行分析。該培養基中的氨基酸添加情況如下:①不添加氨基酸;②添加精氨酸;③添加組氨酸;④添加精氨酸和組氨酸。

(6) 比較鑒定平板上各個克隆的表型以發現具有所要表型的克隆。

(7) 選擇若干具有合適表型的克隆在非選擇性培養 (如 Y P D ) 平板上劃線, 從每個克隆劃線產生的單克隆中挑取克隆，單個克隆在同一套鑒定平板上重新鑒定。該步驟非常重要，因為畢赤酵母的孢子一個挨一個非常緊密的黏附在一起, 因此其萌發產生的克隆通常包含從不止一個孢子分化出來的細胞。孢子聚集的另一個結果是標記基因并不是按照I : 1 的比例分離 (segregate), 而是傾向于顯性 (dominant) 表型或野生型表型。例 如 ，上述 his4 菌 株 和 arg4 菌株交配時，His⁺A r g ⁺ 表 型 的 孢 子 所 占 比 例 超 過 預 計 的 2 5 % ，而His^- A r g ^- 表型的孢子數量則低于預期。

三、基因制備和載體選擇

在選擇畢赤酵母表達載體時首先要考慮的是需要分泌表達還是胞內表達。一 般的經
驗做法是與該蛋白質在天然宿主中的表達途徑一樣: 如果天然宿主是胞內表達該蛋白質,那么就應該在酵母菌中胞內表達; 如果天然宿主是分泌表達該蛋白質, 那么就在酵母菌中分泌表達。盡管存在例外, 但是最好還是遵循這個規則，因為胞內和分泌的環境非常不同，如果在不合適的空間合成蛋白質將導致其錯誤折疊和失活。人們構建了一系列的載體用于畢赤酵母的表達，這些 載 體 的 名 稱 和 詳 細 信 息 可 以 在 Lin-C e r e g h i n o 和 Lin C e -reghino(2008) 及 littp://w w w .biogrammatics,c o m (圖 13. 1) 中找到。

為了將一段基因克隆人畢赤酵母的表達載體中，可以使用合適的引物通過聚合酶鏈反應對模板進行擴增。當 D N A 需要優化或基因需要改變的時候，從頭合成法可以使克隆變得簡單。在任何情況下，在基因末端都要加上限制性酶切位點以方便克隆。例 如 ，E c o R I 位點可以加在基因 5 ? (含有 A T G )，JV 〇 ( I 位點可以加在 3’端, 這樣就可以很方便地克隆人 p P I C Z 系列載體(Invitrogen， Carlsbad，C A ) 中，當然，前提是所要克隆的基因序列上不存在這些酶切位點。對 來 自 Biogrammatics 公司的畢赤酵母表達載體來說，基因兩側可以添加 11S 型限制性內切核酸酶的酶切位點和「無縫」克隆序列以構建一個理想的克隆表達載體。

克隆一個分泌蛋白的基因要更復雜一些。當使用該蛋白質的天然分泌信號時克隆過程與胞內表達時一樣; 但是, 當使用外源信號序列時就會面臨一些選擇，如表達載體上有釀酒酵母 a 交配因子 (aM F ) 的分泌信號，此 時 ，插入的目標基因就必須要與該信號肽的編碼序列形成一個正確閱讀框?！督慌湟蜃臃置谛盘柍Ｓ糜诜置诒磉_，因為已經證明它能夠很好地分泌表達多種重組蛋白。盡管用《M F 可以成功地分泌表達重組蛋白，但有時在目標蛋白質的 N 端 aM F 不能被正確地加工。此時 ，需 要 對 aM F 進行修飾或用其他的分泌信號才能獲得正確加工的蛋白質。為了正確地加工蛋白質，《M F 信號肽序列和目標蛋白質 N 端之間或許需要插人兩個谷氨酸-兩氨酸重復序列。 Biogr a m m a t i c s 的載體 p J A Z -a M F 可以用來構建含有谷氨酸-丙氨酸重復序列的重組體。 Biogr a m m a t i c s 的其他載體,如 p J A Z -a M F -K R , 它在克隆位點上不含有谷氨酸和丙氨酸重復序列。要 想 在 p P I C Z a 載體上利用 a M F 信號，必須在基因的 5’端添加一定的序列，這樣當將外源序列連接到載體上時，aM F 信號序列可以得到重建 (不管 aM F 中是否含有谷氨酸-丙氨酸重復的編碼序列）。通常 ，用于切割 p F I C Z 載 體 的 X A o [位 于 a M F 信號序列中，為了重建信號序列，需要合成一段寡聚核苷酸：

「A B C D E F …」表示編碼成熟重組蛋白第 1 個 和 第 2 個氨基酸殘基的核苷酸序列。這個寡聚核苷酸將與成熟蛋白的基因的 5’端形成正確的連接，同時恢復了 aM F 序列缺失的部分。類似的, 用于將基因克隆到 Biogrammatics 載體中的無縫克隆技術使用 I I S 型限制性酶切位點，將 A B C D E F 與 aM F 信號肽序列的 C 端最后一個丙氨酸 (A l a) 的編碼序列連接起來。該酶產生了一個 4 個堿基的黏端，這 4 個堿基包括了谷氨酸 (G l u ) 的最后一個編碼核苷酸和丙氨酸 (Ala) 的編碼核苷酸。

四、電穿孔轉化法

目前至少有 4 種 不 同 的 方 法 可 以 將 外 源 質 粒 D N A 導 人 畢 赤 酵 母 中 ： 原生質體(spheroplast-generation) 轉 化 法 、氯 化 鋰（L i C l) 轉 化 法 、 P E G 1000 (polyetheleneglycollOOO) 轉化法和電轉化法 (electroporation)。電轉化法是最常用的，因此，在此詳細列 出 Becker 和 Guarante 改良的電轉化法的操作步驟。至于其他方法，讀者可以參考分
子生物學方法畢赤酵母卷 (Cregg， 2008; HigginsandCregg, 1998)。

五、DNA 的制備

對 于 所 有 的 轉 化 方 法 ，為 了 將 外 源 D N A 整 合 到 畢 赤 酵 母 基 因 組 中 ，人 們 通 常 使 用 線狀 質 粒 D N A 。線 狀 質 粒 D N A 末 端 的 序 列 與 宿 主 基 因 組 整 合 位 點 的 序 列 同 源 ，通 過 一 次單 交 換 完 成 外 源 序 列 的 插 入 。因 此 ，質 粒 的 線 性 化 位 點 通 常 都 位 于 質 粒 上 與 畢 赤 酵 母 基因 組 同 源 的 部 分 , 如 在 啟 動 子 序 列 內 (AOXI 沿 啟 動 子 的 P m e I 位 點 ）。使 用 大 腸 桿 菌 制 備質 粒 后 ，用 限 制 性 內 切 核 酸 酶 使 其 線 性 化 ，經 純 化 和 濃 縮 后 其 終 濃 度 至 少 為 1 〇 〇 n g /uL(溶 于 水 中）。至 此 ，轉 化 畢 赤 酵 母 用 的 載 體 就 準 備 好 了 。

電 轉 感 受 態 細 胞 的 制 備 步 驟 (Lin-Cereghino et a L ，2005)。

1. 實 驗材料 (除了 D T T 和 H E P E S 過濾除菌外，所有的溶液都要高壓滅菌）

( 1 ) 在 2. 8 L 的 馮 巴 赫 (Fernbach) 搖 瓶 中 配 制 500 m L 的 液 體 Y P D 培 養 基 。

( 2 ) 水 (1 L ) 。

(3) I m o l / L 山 梨 醇 (sorbitol) (100 m L ) 。

(4) 適 量 的 篩 選 用 瓊 脂 平 板 。

(5) I m o l / L 二 硫 蘇 糖 醇 (D T T ) (2.5 m L ) 。

(6) B E D S 溶 液 (9 m L ):10 m m o l /L i V -二 羥 乙 基 甘 氨 酸 -氫 氧 化 鈉（bicine^N a O H ),p H 8. 3 , 3 % 乙 二 醇（ethylene glycol) ， 5 % 二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，D M S O ) ，
I m o F L 山 梨 醇 ，0?I m o l / L D T T 。

(7) I m o l /L 羥 乙 基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 (H E P E S ) 緩 沖 液 ，P H 8. 0(50 m L ) 。

(8) 無 菌 的 250 m L 離 心 管 。

(9) 無 菌 的 電 轉 杯（electroporation cuvette) 。

( 1 0 ) 電 轉 儀 ：B T X Electro Cell Manipulator 600 (B T X ， San D i e g o , C A );Bio-RadG e n e PulserCBio-R a d , Hercules, C A ) ；Electroporator II (Invitrogen， S a n D i e g o , C A ) 。
電 轉 參 數 因 儀 器 型 號 不 同 而 有 所 不 同 。使 用 前 請 閱 讀 對 應 型 號 的 說 明 書（Becker andG u arante, 1991； G r e y and Brendel, 1995； Pichia Expression KitInstruction M a n u a l ；
Stowers et al. , 1995)。

2. 操作方法

(1) 挑 取 在 瓊 脂 平 板 上 的 新 鮮 畢 赤 酵 母 單 克 隆 接 種 在 10 m L Y P D 培 養 基 中 ，30°C 振蕩 培 養 過 夜 。

(2) 將 過 夜 培 養 的 酵 母 菌 接 種 到 裝 有 500 m L Y P D 的 2. 8 L F e r a b a c h 培 養 瓶 中 ，此時 〇D _600nm, 大 約 為 0?0 1 ，培 養 至 O D _600nm為 I.0 左 右 (大 約 12 h ) 。

(3) 4°C 2000 g 離 心 收 集 細 胞 ，棄 上 清 液 ，用 1 〇〇 m L 含 有 H E P E S ( p H 8.0,200 m m o l /L ) 的 Y P D 培養基重懸沉淀，轉 移 到 250 m L 離心管中。

(4) 加 入 2. 5 mL 的 I mol/L DTT，輕柔混勻。

(5) 30°C 緩慢旋轉孵育 15 m i n 。

(6) 向培養物中加入 150 mL 冷水，4°C 離心; 再用 250 mL 冷水離心清洗。從這步開始 ，保持細胞在冰冷環境中并且不要振蕩重懸細胞 (最好用吸管緩慢吹打)。

(7) 用 20 mL 冷 的 I m 〇 l/L 山梨醇洗細胞，然 后 用 0.5 mL冷的Im ol/L 山梨醇重懸 (細胞懸液的終體積為 I.0?I.5 mL)。

(8) 直接使用這些未經冷凍的感受態細胞能獲得最多的轉化子。

(9) 每 個 I.5 mL 離心管分裝 40 pL 感受態細胞, 置于一 70°C 凍存。

3. 電 轉 步 驟

(1) 將 I ug 溶于水的線狀質粒 DNA(體積不要超過 5 ML) 加人裝有 40 uL 凍存的或新鮮的感受態細胞的離心管中，將混合物轉移到在冰上預冷的 2 mm 內徑的電轉杯中。

(2) 用電轉儀制造商建議的針對酵母的參數進行電轉 (表 13. 1)。

(3) 電擊后立即加人 0. 5 mL 預 冷 的 I mol/L 山梨醇和 0. 5 mL 預冷的 YPD，然后將電轉杯中所有的菌液轉移到一個 1. 5?2. 0 mL 的離心管中。

(4) 將離心管置于 30°C 緩慢搖動 (100 r/min)，培 養 3. 5?4 h。

(5) 取 1 份電轉產物涂布在選擇性瓊脂平板上，培 養 2?4 天。

(6) 為了避免混合克隆, 在進行下一步分析之前，至少需要再一次挑單克隆在選擇培養基上劃線培養以獲得單克隆。

4. 電 轉 感 受 態 畢 赤 酵 母 的 快 速 制 備

(1) 在 5 mL YPD 培養基中接種畢赤酵母，30°C 搖動培養過夜。

(2) 在 裝 有 50 mL YPD 培養基，能良好通氣的大培養瓶中，稀釋過夜培養的畢赤酵母菌液至 OD_600nm 0. 15?0. 20。

(3) 30°C 搖動培養至 OD_600nm〇.8?1. 0(4?5 h)。

(4) 室 溫 5OOg 離 心 5 min 收集菌體，棄掉上清液。

(5) 在加 有 DTT 的 9 mL 預冷 的 BEDS 溶液中重懸沉淀。

(6) 30°C 搖 動 孵 育 重 懸 液 5 m i n 。

(7) 室 溫 500 g離心 5 m i n 收 集 菌 體 ，用 I m L B E D S 重 懸 (不 含 有 D T T ) 。

(8) 按 照 上 述 電 轉 化 步 驟 進 行 電 轉 , 或 者 立 即 分 裝 細 胞 并 將 其 凍 存 在 一 80°C 。

六、重組蛋白表達菌株的鑒定

酵 母 表 達 系 統 已 經 成 功 地 用 于 重 組 蛋 白 的 大 量 制 備 ，如 I L 酵 母 培 養 液 上 清 液 中 能夠 獲 得 1? 10 g 分 泌 表 達 的 重 組 蛋 白 。但 是 ，可 能 在 初 次 嘗 試 表 達 時 不 能 夠 在 考 馬 斯 亮藍 染 色 的 凝 膠 中 看 到 目 標 蛋 白 質 的 條 帶 。因 此 ，非 常 有 必 要 在 使 用 構 建 好 的 重 組 菌 株 進行 蛋 白 質 表 達 前 ，準 備 好 一 種 或 多 種 更 為 靈 敏 的 檢 測 方 法 ?？?以 利 用 目 標 產 物 的 酶 活 性 、目 標 產 物 上 融 合 的 表 位 標 簽 或 目 標 產 物 的 特 異 性 抗 體 來 進 行 檢 測 。但 關 鍵 在 于 : 建 立 靈敏 檢 測 方 法 的 工 作 應 該 與 表 達 同 時 進 行 或 先 于 表 達 進 行 。如 下 例 所 示 ，好 的 檢 測 方 法 能夠 大 大 方 便 菌 株 的 構 建 。

檢 測 酵 母 表 達 的 外 源 蛋 白 最 便 捷 的 方 法 是 平 板 活 性 實 驗 。該 實 驗 可 以 進 行 粗 略 的 定量 。通 過 平 板 影 印 或 別 的 技 術 將 菌 落 影 印 到 另 一 個 平 板 上 ，能 夠 對 100? 1 0 0 0 個 轉 化 子的 表 達 水 平 進 行 直 接 比 較 。

圖 I3. 2 顯示了 使 用 平 板 活 性 實 驗 檢 測 分 泌 表 達 的 肌 醇 六 憐 酸 酶（phytase) 的 例 子 。這 種 酶 可 降 解 肌 醇 六 磷 酸 (phytate)，它 能 使 瓊 脂 平 板 上 表 達 該 酶 的 酵 母 克 隆 的 周 圍區域變 得 澄 清 。澄 清 區 域 的 大 小 與 肌 醇 六 磷 酸 酶 的 分 泌 量 相 關 。第 二 個 例 子 ，畢 赤 酵 母 胞 內表 達 細 菌 β-內酰胺酶 (β-lactamase)( 圖 13.3)。 通 常 畢 赤 酵 母 的 克 隆 呈 黃 色 ，表 達 斤 內 酰胺 酶 時 會 由 粉 色 轉 為 紫 色 。紫 色 的 深 度 與 酶 的 表 達 量 有 關 ，在 這 里 ，也 就 是 與 菌 株 的 表 達框 的 拷 貝 數 有 關 。最 后 指 出 ： 如 下 所 述 ，可 以 用 高 質 量 的 針 對 標 簽 區 域 或 重 組 蛋 白 自 身 的多 克 隆 抗 體 或 單 克 隆 抗 體 進 行 平 板 抗 體 實 驗 或 酵 母 印 跡 實 驗 。

轉 化 子 被 篩 選 出 來 后 ，分 離 出 單 細 胞 并 收 集 在 作 為 主 平 板 的 平 板 上 ，來 源 于 多 個 轉 化子 的 樣 品 將 被 用 于 檢 測 外 源 蛋 白 的 表 達 情 況 。在 這 之 前 ，可 以 通 過 PCR 篩 選 含 有 重 組 基因 的 轉 化 子 。如 下 所 述 ，用 玻 璃 珠 破 碎 法 在 無 細 胞 抽 提 系 統 中 提 取 出 基 因 組 D N A ，用 其作 為 模 板 ，使 用 與 重 組 基 因 兩 側 互 補 的 引 物 進 行 PC R 反 應 。根 據 使 用 何 種 啟 動 子 表 達 蛋白 (誘 導 型 的 和 組 成 型 的 ) 和 使 用 哪 種 表 達 載 體 (胞 內 的 或 分 泌 的），有 不 同 的 檢 測 方 法 用于 表 達 蛋 白 的 檢 測 。

( 1 ) 如 果 目 的 基 因 的 表 達 是 組 成 型 的 ，接 種 單 克 隆 在 YPD 培 養 基 中 ，良 好 通 氣 的 情況 下 培 養 2 ?3 天 ，在 這 段 時 間 里 可 以 用 各 種 可 行 的 檢 測 方 法 在 不 同 的 時 間 點 分 析 蛋 白 質的 表 達 。

( 2 ) 對 于 甲 醇 誘 導 型 表 達 ，首 先 在 Y PD 培 養 基 中 接 種 單 克 隆 并 培 養 17? 24 h ，然 后轉 移 到 添 加 有 甲 醇 的 新 鮮 培 養 基 中 誘 導 。誘 導 時 通 氣 要 好 , 菌 的OD_600nm在 1 0 左 右 ，在裝有 2 n iL 培 養 基 (含 有 0 . 5 % 甲 醇 ) 的 15 m L 試 管 中 進 行 。對 于 胞 內 表 達 的 蛋 白 質 ，甲醇誘 導 6? 12 h 就 足 夠 了 。

胞內表達的樣品需要制備細胞提取物后進行分析。收集培養 10?12 h 的酵母菌，使用玻璃球破碎法裂解細胞。準 備 10?50 個 OD_600nm單位的細胞, 用 150 uL 裂解緩沖液重懸 。加人等體積用無菌的酸洗過的直徑 0.45 m m 的玻璃球。最大轉速渦旋振蕩混合I m in, 然后將混合物放置冰上 I m in; 重復上述操作至少 5 次?；蛘邔⒀b有樣品的離心管放置在可以容納多個離心管的渦旋振蕩器中。將振蕩器置于 4℃；冰盒中或冷室中，以最高速振蕩大約 10 m in。在顯微鏡下檢查細胞的破碎情況，此時, 應該可以觀察到 8 〇%?9 0 % 的細胞已經破碎。細胞破碎后，將細胞碎片和緩沖液一起轉移到一個新的離心管中，另 用 100 uL 裂解緩沖液振蕩清洗玻璃球然后將洗液轉移至上述同一離心管中。 4℃高速離 心 5 m i n ，將包含目標蛋白質的上層水相轉移到新離心管中。 這 就 是 用 于 S D S -p A G E 、蛋白質印跡或酶學分析的粗提蛋白質樣品。

分 泌 蛋 白 在 培 養 基 中 積 累 很 緩 慢 ，至 少 要 培 養 2 天 才 能 達 到 高 峰 ?？?以 振 搖 誘 導 2?5 天 ，期 間 每 12 h 加 入 新 鮮 甲 醇 至 終 濃 度 為 〇 ?5 % 并 收 集 50? 100 上 清 樣 品 。上 清 樣品 可 以 進 行 SDS-PAGE、蛋 白 質 印 跡 或 酶 學 反 應 分 析 ，也 可 以 一 20°C 凍 存 。

七、分 析 方 法 的 建 立 —酵母印 跡 法

使用抗體的各種不同分析方法有許多相似之處。酵母克隆蛋白質印跡法是一種很有用的、酵母特異性的抗體分析方法。它有時候被稱為分泌蛋白的酵母印跡法 (「Yeastem」Blot)(圖 13. 4)。對于標準的蛋白質印跡法操作步驟，請 參 考 Sam brook 等 (1989)。

酵 母 印 跡 是 一 種 很 便 捷 的 直 接 在 平 板 上 大 量 篩 選 重 組 蛋 白 表 達 菌 株 的 方 法 。但 是 ，讀 者 應 該 明 白 ，克 隆 周 圍 光 暈 的 大 小 和 重 組 蛋 白 的 量 并 不 總 是 線 性 相 關 ，這 種 方 法 得 出 的所 有 結 果 都 應 該 用 標 準 的 蛋 白 質 印 跡 法 或 其 他 的 檢 測 方 法 加 以 驗 證 。酵 母 印 跡 法 的 操 作步 驟 如 下 所 述 。

( 1 ) 將 瓊 脂 平 板 表 面 的 新 鮮 酵 母 克 隆 用 標 準 的 平 板 影 印 法 轉 移 到 一 張 無 菌 的 Whatman No. 1 濾 紙 上 。濾 紙 應 剪 成 大 小 能 剛 好 放 進 平 板 中 。

( 2 ) 將 粘 有 酵 母 細 胞 的 濾 紙 放 在 含 有 適 量 誘 導 培 養 基 的 新 鮮 平 板 表 面 ，然 后 培 養 1?2 天 。

( 3 ) 準 備 一 張 大 小 和 上 述 濾 紙 一 樣 的 硝 酸 纖 維 素 膜 ，用 至 少 15 m L 電 轉 緩 沖 液[25mmol/L Tris(pH8.5),0.2 111 〇 1/乙甘氨酸，20% 甲 醇 將 該 膜 浸 泡 5min或更長時間。在 電 轉 緩 沖 液 中 再 浸 濕 兩 張 剪 好 的 濾 紙 。

( 4 ) 按 照 下 述 方 法 準 備 濾 紙 和 硝 酸 纖 維 素 膜 的 三 明 治 。

① 將 一 張 濾 紙 放 置 在 印 跡 裝 置 的 陽 極 (移 除 膜 之 間 的 所 有 氣 泡 是 很 有 必 要 的 ，可以用 移 液 管 在 濾 紙 表 面 滾 動 去 除 氣 泡）。

② 將 浸 濕 的 硝 酸 纖 維 素 膜 放 在 濾 紙 上 。

③ 將 影 印 有 平 板 上 酵 母 細 胞 的 濾 紙 放 在 硝 酸 纖 維 素 膜 的 上 面 。

④ 放 置 第 二 層 浸 濕 的 濾 紙 在 有 酵 母 細 胞 的 濾 紙 上 層 。

⑤ 最 后 ，將 陰 極 板 放 在 三 明 治 的 最 上 層

(5) 用恒定的電流 (1?4 mA/cm2) 作 用 I h 將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。

(6) 移走硝酸纖維素膜，將 其 在 15 m L 的 T B S 緩 沖 液 [50 m m d/L Tris-HCKpH7.6), 150m m ol/L 氯化鈉] 中洗 5 m in。之后, 將 T B S 緩沖液換成含有 1% ?5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 TBST(加 Tween-20 在 T B S 至終濃度為 0. 0 5 % ) 。置硝酸纖維素膜于封閉緩沖液中, 室溫緩慢搖動 I h 。

(7) 將濾膜轉移到 15 HiL T B S T 中室溫搖動 5 m in。

(8) 準 備 好 15 mL 封 閉 緩 沖 液 稀 釋 的 一 抗（按 照 供 貨 商 推 薦 用 量 稀 釋 ，一般為0.5 ug/mL)。

(9) 將膜和一抗在 2?8°C 緩慢搖動孵育過夜 (也可以根據所用抗體，縮短至在室溫下孵 育 1?3 h)。

(10) 用 15 mL T B S T 緩沖液至少洗膜 4 次 (每 次 5 min)，最后用新鮮 T B S T 快速沖洗 膜 。

(11) 根據供貨商推薦的用量在封閉緩沖液中稀釋酶標二抗 (一 般 在 15 m L 封閉緩沖液 中 加 3 ， 抗體)。

(12) 將稀釋的二抗和膜于室溫搖動孵育 I h 。

(13) 重復步驟 (10)。

(14) 在暗室中，根據供貨商的建議，使 用 顯 色 劑（visualization reagent) 處 理 膜（如Pierce E C L 蛋白質印跡底物），然后用濾紙移除膜上多余的液體，將膜放置在塑料的保護盒 中 ，使 用 X 射線感光膠片對整張膜曝光 30 s 至數分鐘。每個克隆周圍的信號強度和大小大致可以反映出該克隆/菌株表達分泌重組蛋白的水平。

八、重組蛋白的翻譯后修飾 (蛋白酶和糖基化）

在畢赤酵母中包括蛋白酶解和糖基化在內的翻譯后修飾會影響重組蛋白的質量。

如果最初的 SDS-P A G E 分析顯示目標蛋白質發生了降解, 那么可以嘗試畢赤酵母的蛋白酶缺陷株。較低的重組蛋白表達水平和有活性的或有免疫活性的產物小于全長產物顯示蛋白酶發生了降解。降解的蛋白質也可能在 P A G E 電泳上顯示為彌散的條帶，條帶分布在從分子質量的正常大小到較小的位置。畢赤酵母菌株 SMD1168(pep4 his4) 的大部 分 P E R 基因被刪除 (Gleeson et al.， IM S)。該基因負責活化畢赤酵母液泡中的許多蛋白酶。這些蛋白酶最初以非活性的酶原形式進入液泡，在 液 泡 中 被 P ￡T 4 產物激活。盡管分泌型的重組蛋白不會進人液泡，但是它們在培養基中會接觸到小量細胞裂解后釋放的此類蛋白酶畢赤酵母在培養時的密度非常高, 這會導致在培養基中的液泡蛋白酶濃度達到不能忽視的水平。為 了 利 用 PEP4 菌株進行表達，你要么使用你的質粒轉化SMD1168(p 印 4 his4) 或 SMD1168 H (pep4) 等菌株，要么在已經表達目標蛋白質的菌株上刪 除 基因。 為了確定缺失PEP4 對蛋白質表達是否有利，需要在平行誘導完成后對 野 生 型 和 缺 失 株 表 達 的 重 組 蛋 白 進 行 檢 測 。注意:平板上保存的 P E P 4 缺失株會更快死亡，而且不如野生型菌株容易轉化，生長得更慢，在甲醇培養基中更難誘導，尤其是 P f P4 缺失菌株很難與其他非 P E P 4 畢赤酵母菌株交配。

如 果 S DS- P A G E 顯 示 畢 赤 酵 母 中 表 達 的 重 組 蛋 白 較 預 期 的 大 ，或 者 大 小 不 一 ，那么該 蛋 白 質 可 能 被 糖 基 化 了 。你 應 該 首 先 檢 査 氨 基 酸 序 列 以 尋 找 潛 在 的 糖 基 化 位 點 :A S N -X -S e r / T h r 序 列 是 存 在 JV-糖 基 化 的 信 號 ; 任 何 S e r 或 T h r 位 點 的 一 O H 基 團 都 可 能 出 現O 糖 基 化 ?？?以 用 肽 N-糖 苷 酶 F (FPNGaSe F ，peptideN -glyc 〇 sidase F ) 處 理 可 疑 的 糖基 化 蛋 白 以 去 糖 基 化 ，然 后 通 過 S D S ^ P A G E 對 產 物 大 小 進 行 檢 測 。 從 http://www.neb.com/nebecomm/piroducts/productP0704. asp 可 以 找 到 一 個 很 好 的 蛋 白 質 去糖 基 化 的 方 法 。如 果 經 過 糖 苷 酶 處 理 后 蛋 白 質 的 分 子 質 量 變 小 ，而 且 更 為 均 一 ，那 么 幾 乎可 以 確 定 這 個 蛋 白 質 是 被 糖 基 化 了 。

九、挑 選 具 有 多 拷 貝 表 達 框 的 克 隆

在畢赤酵母表達系統中，最常用的增加重組蛋白表達量的方法或許就是增加菌株中
表達框（expression cassette) 的拷貝數（Brierley，1998; Thill et al.，1990)。有兩種方法可以用來構建具有多拷貝表達框的菌株。第一種方法是構建一個擁有多個頭尾相接的表達框 (Brierley，1998) 的載體。構建這個載體的關鍵是載體的表達框的兩側有限制性內切核酸酶的酶切位點, 而且必須能夠切出互補的末端（如 Baw HI-B g m 、SaZI-X/io I 這樣的組合）。重復進行切開和插人的操作會產生一系列表達框拷貝數逐漸增多的載體。這種方案有一個獨有的優勢 (尤其在人用藥物制品方面） ，即表達框的確切數量非常清楚，而且可以通過 D N A 測序進行直接確認。

這種篩選方法的一個缺點是很難獲得足夠多的克隆用于篩選含有高拷貝表達框的菌
株 。首先 ，耐高濃度藥物的轉化子數量很低，通常只占低耐藥性 (1 〇〇 ug/m L 的抗生素)轉化子數量的〇.1 % ?1. 0 % 。因此，只有在最高轉化效率的情況下，才可能會有耐高濃度藥物的轉化子出現。其 次 ，需 要 50?100 個轉化子來篩選高拷貝菌株，這是因為在顯示高耐藥性的轉化子中，只 有 1 % ?5 % 是由于細胞內具有多拷貝的表達框，更多的菌株的耐藥性來自于其他未知因素。

在某種程度上，由于通過直接篩選獲得多拷貝菌株有一定的難度，人們發展了另外一
種獲得高拷貝和高重組蛋白表達水平的菌株的方法 (Sunga et al., 2008)。 簡單地說, 使用更高藥物濃度從在較低藥物濃度水平篩選出來的只具有一個或幾個表達框拷貝的畢赤酵母轉化子中篩選獲得具有更高拷貝表達框的菌株, 也就是在逐漸提高濃度的抗生素平板上劃線來進行篩選。例如，在 100 ug/m L 的抗生素平板上篩選獲得最初的轉化子，接下來將這些轉化子在含有 500 ug/mL 的抗生素平板上劃線。收集在較高抗生素濃度下能夠生長的克隆作為單個菌 株 ，然后確認這些菌株中的一個或多個具有升高的重組蛋白表達水平以及通過 P C R 確認高耐藥性的獲得緣于含有較多拷貝的載體。一旦某個菌株被確認為是更高表達水平/更多拷貝數的菌株，就重復之前的步驟繼續用更高的抗生素濃度 (2 mg/mL) 進行篩選。再 一 次獲得更高耐藥性的菌株并檢測重組蛋白的表達量和載體拷貝數。這 種反復篩選的過程稱為轉化后載體擴增法 （p 〇 sttransformationa[ vectoramplification,PTV A)。利用這個方法可以獲得具有多個頭尾相接載體拷貝的菌株, 這些載體通常整合進基因組的單一位點。對 P T V A 法篩選得到的克隆的分析顯示，它們中有4 0 % 的載體拷貝數有 3?5 倍的增加。被稱為「頭獎」(jackpot) 的那些克隆具有 10 個以上的表達載體的拷貝，它們占所篩選出的克隆的 5 % ?6 % , 某些克隆的重組蛋白的產量具有相應比例的提高。

盡管這種載體拷貝數擴增過程的分子機制仍然不清楚, 但對該過程已經有了一些關
鍵發現。首先，這種擴增能夠在含有任何一種載體的菌株中小比例自然地發生。其 次 ，PTVA 過程導致了整個載體的擴增，而不僅僅是擴增載體的一部分, 如耐藥基因。顯而易見 ，這點在需要獲得均一重組蛋白產物時非常重要。再次，D N A 印跡數據表明，所有的拷貝都像原始拷貝一樣，在相同的位置插入到畢赤酵母基因組中，且以首尾相連的構象存在。

最后指出的是，PTVA 法對具有其他藥物抗性篩選標記的載體同樣有效。并不僅限
于抗生素載體。因 此 , 這個擴增過程似乎是該種酵母菌對高藥物濃度的一個通常的反應?？紤]到其他品種的酵母菌也有類似的同源重組系統，這個技術也應該適用于其他種類的酵母菌。##一、培養基和微生物操作技術
在 實 驗 室 水 平 培 養 畢 赤 酵 母 菌 及 其 他 大 部 分 酵 母 菌 的 技 術 與 培 養 大 腸 桿 菌 和 釀 酒 酵母 菌 類 似 。最 常 用 的 豐 富 培 養 基 是 Y P D [ 1 % 酵 母 提 取 物（yeast extrac0 、2 % 蛋 白 胨
(peptone) 、2 % 葡 萄 糖（dextrose) ] 培 養 基 ，最 常 用 的 確 定 成 分 培 養 基 是 Y N B 培 養 基0. 6 7 % 的 含 硫 酸 銨 不 含 氨 基 酸 的 酵 母 氮 源（yeast nitrogen base) 、2 % 葡 萄 糖 、50 p g / m L
的 任 何 生 長 必 需 的 氨 基 酸 和 核 苷 酸 ]。必 赤 酵 母 利 用 甲 醇 生 長 時 需 要 將 培 養 基 中 的 葡 萄 糖替 換 成 0 . 5 % 的 甲 醇 。交 配 /產 孢 (mating/spomlation) 培 養 基 由 0 . 5 % 乙 酸 鈉 、1 % 氯 化 鉀 、1 % 葡 萄 糖 組 成 。培 養 基 中 加 入 2 % 瓊 脂 后 可 以 制 成 培 養 平 板 (Petri plate)。培 養 通 常 在30°C 進 行 。在 Y P D 液 體 培 養 基 中 ，畢 赤 酵 母 的 代 時 大 約 是 90 m i n ; 在 確 定 成 分 的 培 養 基 中代 時 大 約 是 3 h 。如 果 甲 醇 作 為 唯 一 碳 源 ，那 么 在 確 定 成 分 培 養 基 中 的 代 時 大 約 是 5 h 。

二、遺傳株的構建

盡管畢 赤 酵 母 有 多 種 類 型 的 標 志 物 (marker)，但 滿 足 研 究 人 員 的 目 標 標 志 物 組 合 可能 并 不 存 在 。因 此 ，構 建 一 套 具 有 最 理 想 標 志 物 的 宿 主 菌 是 很 有 必 要 的 。構 建 菌 株 的 第
— 步是 交 配 并 篩 選 二 倍 體 (diploid)(Tolstorukov and Cregg, 2008)。 因 為 畢 赤 酵 母 在 功能 上 是 同 宗 結 合 的 (homothallic), 且 同 株 的 細 胞 間 也 會 發 生 交 配 ，因 此 在 計 劃 進 行 交 配 時
不 用 考 慮 菌 株 的 交 配 型 。但 是 , 畢 赤 酵 母 間 的 交 配 效 率 較 低 ，因 此 進 行 交 配 的 菌 株 具 有 互補的標記是非常必要的，這些標記能夠允許雜交產生的二倍體選擇性生長但抑制自身交配產生的二倍體和親代株的生長。營養缺陷（auxotrophic) 標記在使用時最為便利。但是能夠影響生長或其他表型的基因突變，如影響對甲醇或某種氮源（甲胺) 利用的基因突變也是很好的標記。下面是畢赤酵母交配的操作步驟。

1. 交 配 ，生成二倍體

(1)首先 從 Y P D 平板上挑取待交配菌株的新鮮克隆 (不要超過 1 周），然 后 在 另 外 2塊 Y P D 平板上分別劃出多條平行的菌線。

(2) 30°C 培養過夜，將 2 塊劃線平板上的酵母菌轉移到 1 塊無菌的絲絨布上, 此時，要 使 2 塊平板上的菌線互相垂直。

(3) 將絲絨布上互相交叉的菌線轉移到交配/孢子生成平板上，室 溫 下 培 養 2?3 天后開始交配。

(4) 在培養后，將交配/孢子生成平板上的酵母菌影印復制到另一個含有合適培養基
的瓊脂平板上篩選互補的二倍體。二倍體克隆會在 30°C 孵 育 2?3 天后長在劃線的交叉處 。畢赤酵母二倍體的大小大約是單倍體的 2 倍 ，通過光學顯微鏡可以依據孢子的大小和較高的孢子生成效率來辨識。

(5) 在二倍體選擇培養基上通過劃菌線的方法得到二倍體的單克隆。

(6) 在缺少氮源的情況下，畢赤酵母二倍體能高效地進行減數分裂并生成孢子。為
了使二倍體進入這種生命狀態，用平板影印法或用接種環直接將新鮮二倍體克隆 (生長在添加有葡萄糖的 Y P D 平板上) 轉移到交配/孢子生成平板; 在室溫培養 3?4 天 。所有生成孢子的畢赤酵母在孢子囊中會聚集紅色色素，因此生成孢子褐色的二倍體可以很容易地與相對白色的單倍體區別開來。還可以通過普通顯微鏡或相差顯微鏡觀察培養中出現的大量子囊 (a s d) 來辨識出二倍體。

2. 隨機孢子分析

畢赤酵母孢子很小且彼此黏在一起。這使得通過顯微操作技術分離四分孢子（ tetrad dissection) 變得很難。因此，獲得的孢子需要進行隨機孢子分析 ( r a n d o m spore analysis，R S A )，過程如下所述。

( 1 ) 用接種環將畢赤酵母孢子 (來自上一過程第 6 步) 轉移到裝有 0. 25 m L 無菌水的I.5 m L 離心管中，渦旋振蕩混勻。

(2) 在通風櫥中向孢子樣品中加人 0. 25 m L 二乙醚 (diethyl ether), 室溫徹底禍旋振蕩 大 約 5 m i n 。用乙醚處理可以選擇性的殺死存留在孢子中的營養體。

(3) 仍然在通風櫥中，離 心 2 m i n ，吸出上層的乙醚，用下層的水重懸孢子沉淀。取出10 uL 或 I O O uL 重懸液涂布到非選擇 Y P D 平板。

(4) 30°C 培養 4?5 天 ，挑取單克隆在新鮮 Y P D 平板上劃線，作為進一步分析用的主平板（master plate)。

(5) 將主平板上的菌落影印復制到含有合適分析培養基的一系列平板上?；蛘? 直
接影印復制最初的平板上的 1 〇〇 ?600 個克隆。例 如 ，h 1 S4 菌 株 和 arg4 菌株交配后獲得的孢子可以在添加有葡萄糖的 Y N B 培養基中進行分析。該培養基中的氨基酸添加情況如下:①不添加氨基酸;②添加精氨酸;③添加組氨酸;④添加精氨酸和組氨酸。

(6) 比較鑒定平板上各個克隆的表型以發現具有所要表型的克隆。

(7) 選擇若干具有合適表型的克隆在非選擇性培養 (如 Y P D ) 平板上劃線, 從每個克隆劃線產生的單克隆中挑取克隆，單個克隆在同一套鑒定平板上重新鑒定。該步驟非常重要，因為畢赤酵母的孢子一個挨一個非常緊密的黏附在一起, 因此其萌發產生的克隆通常包含從不止一個孢子分化出來的細胞。孢子聚集的另一個結果是標記基因并不是按照I : 1 的比例分離 (segregate), 而是傾向于顯性 (dominant) 表型或野生型表型。例 如 ，上述 his4 菌 株 和 arg4 菌株交配時，His⁺A r g ⁺ 表 型 的 孢 子 所 占 比 例 超 過 預 計 的 2 5 % ，而His^- A r g ^- 表型的孢子數量則低于預期。

三、基因制備和載體選擇

在選擇畢赤酵母表達載體時首先要考慮的是需要分泌表達還是胞內表達。一 般的經
驗做法是與該蛋白質在天然宿主中的表達途徑一樣: 如果天然宿主是胞內表達該蛋白質,那么就應該在酵母菌中胞內表達; 如果天然宿主是分泌表達該蛋白質, 那么就在酵母菌中分泌表達。盡管存在例外, 但是最好還是遵循這個規則，因為胞內和分泌的環境非常不同，如果在不合適的空間合成蛋白質將導致其錯誤折疊和失活。人們構建了一系列的載體用于畢赤酵母的表達，這些 載 體 的 名 稱 和 詳 細 信 息 可 以 在 Lin-C e r e g h i n o 和 Lin C e -reghino(2008) 及 littp://w w w .biogrammatics,c o m (圖 13. 1) 中找到。

為了將一段基因克隆人畢赤酵母的表達載體中，可以使用合適的引物通過聚合酶鏈
反應對模板進行擴增。當 D N A 需要優化或基因需要改變的時候，從頭合成法可以使克隆變得簡單。在任何情況下，在基因末端都要加上限制性酶切位點以方便克隆。例 如 ，E c o R I 位點可以加在基因 5 ? (含有 A T G )，JV 〇 ( I 位點可以加在 3’端, 這樣就可以很方便地克隆人 p P I C Z 系列載體(Invitrogen， Carlsbad，C A ) 中，當然，前提是所要克隆的基因序列上不存在這些酶切位點。對 來 自 Biogrammatics 公司的畢赤酵母表達載體來說，
基因兩側可以添加 11S 型限制性內切核酸酶的酶切位點和「無縫」克隆序列以構建一個理想的克隆表達載體。

克隆一個分泌蛋白的基因要更復雜一些。當使用該蛋白質的天然分泌信號時克隆過
程與胞內表達時一樣; 但是, 當使用外源信號序列時就會面臨一些選擇，如表達載體上有釀酒酵母 a 交配因子 (aM F ) 的分泌信號，此 時 ，插入的目標基因就必須要與該信號肽的編碼序列形成一個正確閱讀框?！督慌湟蜃臃置谛盘柍Ｓ糜诜置诒磉_，因為已經證明它能夠很好地分泌表達多種重組蛋白。盡管用《M F 可以成功地分泌表達重組蛋白，但有時在目標蛋白質的 N 端 aM F 不能被正確地加工。此時 ，需 要 對 aM F 進行修飾或用其他的分泌信號才能獲得正確加工的蛋白質。為了正確地加工蛋白質，《M F 信號肽序列和目標蛋白質 N 端之間或許需要插人兩個谷氨酸-兩氨酸重復序列。 Biogr a m m a t i c s 的載體 p J A Z -a M F 可以用來構建含有谷氨酸-丙氨酸重復序列的重組體。 Biogr a m m a t i c s 的其他載體,如 p J A Z -a M F -K R , 它在克隆位點上不含有谷氨酸和丙氨酸重復序列。要 想 在 p P I C Z a 載體上利用 a M F 信號，必須在基因的 5’端添加一定的序列，這樣當將外源序列連接到載體上時，aM F 信號序列可以得到重建 (不管 aM F 中是否含有谷氨酸-丙氨酸重復的編碼序列）。通常 ，用于切割 p F I C Z 載 體 的 X A o [位 于 a M F 信號序列中，為了重建信號序列，需要合成一段寡聚核苷酸：

「A B C D E F …」表示編碼成熟重組蛋白第 1 個 和 第 2 個氨基酸殘基的核苷酸序列。這個寡聚核苷酸將與成熟蛋白的基因的 5’端形成正確的連接，同時恢復了 aM F 序列缺失的部分。類似的, 用于將基因克隆到 Biogrammatics 載體中的無縫克隆技術使用 I I S 型限制性酶切位點，將 A B C D E F 與 aM F 信號肽序列的 C 端最后一個丙氨酸 (A l a) 的編碼序列連接起來。該酶產生了一個 4 個堿基的黏端，這 4 個堿基包括了谷氨酸 (G l u ) 的最后一個編碼核苷酸和丙氨酸 (Ala) 的編碼核苷酸。

四、電穿孔轉化法

目前至少有 4 種 不 同 的 方 法 可 以 將 外 源 質 粒 D N A 導 人 畢 赤 酵 母 中 ： 原生質體(spheroplast-generation) 轉 化 法 、氯 化 鋰（L i C l) 轉 化 法 、 P E G 1000 (polyetheleneglycollOOO) 轉化法和電轉化法 (electroporation)。電轉化法是最常用的，因此，在此詳細列 出 Becker 和 Guarante 改良的電轉化法的操作步驟。至于其他方法，讀者可以參考分
子生物學方法畢赤酵母卷 (Cregg， 2008; HigginsandCregg, 1998)。

五、DNA 的制備

對 于 所 有 的 轉 化 方 法 ，為 了 將 外 源 D N A 整 合 到 畢 赤 酵 母 基 因 組 中 ，人 們 通 常 使 用 線狀 質 粒 D N A 。線 狀 質 粒 D N A 末 端 的 序 列 與 宿 主 基 因 組 整 合 位 點 的 序 列 同 源 ，通 過 一 次單 交 換 完 成 外 源 序 列 的 插 入 。因 此 ，質 粒 的 線 性 化 位 點 通 常 都 位 于 質 粒 上 與 畢 赤 酵 母 基因 組 同 源 的 部 分 , 如 在 啟 動 子 序 列 內 (AOXI 沿 啟 動 子 的 P m e I 位 點 ）。使 用 大 腸 桿 菌 制 備質 粒 后 ，用 限 制 性 內 切 核 酸 酶 使 其 線 性 化 ，經 純 化 和 濃 縮 后 其 終 濃 度 至 少 為 1 〇 〇 n g /uL(溶 于 水 中）。至 此 ，轉 化 畢 赤 酵 母 用 的 載 體 就 準 備 好 了 。

電 轉 感 受 態 細 胞 的 制 備 步 驟 (Lin-Cereghino et a L ，2005)。

1. 實 驗材料 (除了 D T T 和 H E P E S 過濾除菌外，所有的溶液都要高壓滅菌）

( 1 ) 在 2. 8 L 的 馮 巴 赫 (Fernbach) 搖 瓶 中 配 制 500 m L 的 液 體 Y P D 培 養 基 。

( 2 ) 水 (1 L ) 。

(3) I m o l / L 山 梨 醇 (sorbitol) (100 m L ) 。

(4) 適 量 的 篩 選 用 瓊 脂 平 板 。

(5) I m o l / L 二 硫 蘇 糖 醇 (D T T ) (2.5 m L ) 。

(6) B E D S 溶 液 (9 m L ):10 m m o l /L i V -二 羥 乙 基 甘 氨 酸 -氫 氧 化 鈉（bicine^N a O H ),p H 8. 3 , 3 % 乙 二 醇（ethylene glycol) ， 5 % 二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，D M S O ) ，
I m o F L 山 梨 醇 ，0?I m o l / L D T T 。

(7) I m o l /L 羥 乙 基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 (H E P E S ) 緩 沖 液 ，P H 8. 0(50 m L ) 。

(8) 無 菌 的 250 m L 離 心 管 。

(9) 無 菌 的 電 轉 杯（electroporation cuvette) 。

( 1 0 ) 電 轉 儀 ：B T X Electro Cell Manipulator 600 (B T X ， San D i e g o , C A );Bio-RadG e n e PulserCBio-R a d , Hercules, C A ) ；Electroporator II (Invitrogen， S a n D i e g o , C A ) 。
電 轉 參 數 因 儀 器 型 號 不 同 而 有 所 不 同 。使 用 前 請 閱 讀 對 應 型 號 的 說 明 書（Becker andG u arante, 1991； G r e y and Brendel, 1995； Pichia Expression KitInstruction M a n u a l ；
Stowers et al. , 1995)。

2. 操作方法

(1) 挑 取 在 瓊 脂 平 板 上 的 新 鮮 畢 赤 酵 母 單 克 隆 接 種 在 10 m L Y P D 培 養 基 中 ，30°C 振蕩 培 養 過 夜 。

(2) 將 過 夜 培 養 的 酵 母 菌 接 種 到 裝 有 500 m L Y P D 的 2. 8 L F e r a b a c h 培 養 瓶 中 ，此時 〇D _600nm, 大 約 為 0?0 1 ，培 養 至 O D _600nm為 I.0 左 右 (大 約 12 h ) 。

(3) 4°C 2000 g 離 心 收 集 細 胞 ，棄 上 清 液 ，用 1 〇〇 m L 含 有 H E P E S ( p H 8.0,200 m m o l /L ) 的 Y P D 培養基重懸沉淀，轉 移 到 250 m L 離心管中。

(4) 加 入 2. 5 mL 的 I mol/L DTT，輕柔混勻。

(5) 30°C 緩慢旋轉孵育 15 m i n 。

(6) 向培養物中加入 150 mL 冷水，4°C 離心; 再用 250 mL 冷水離心清洗。從這步開始 ，保持細胞在冰冷環境中并且不要振蕩重懸細胞 (最好用吸管緩慢吹打)。

(7) 用 20 mL 冷 的 I m 〇 l/L 山梨醇洗細胞，然 后 用 0.5 mL冷的Im ol/L 山梨醇重懸 (細胞懸液的終體積為 I.0?I.5 mL)。

(8) 直接使用這些未經冷凍的感受態細胞能獲得最多的轉化子。

(9) 每 個 I.5 mL 離心管分裝 40 pL 感受態細胞, 置于一 70°C 凍存。

3. 電 轉 步 驟

(1) 將 I ug 溶于水的線狀質粒 DNA(體積不要超過 5 ML) 加人裝有 40 uL 凍存的或新鮮的感受態細胞的離心管中，將混合物轉移到在冰上預冷的 2 mm 內徑的電轉杯中。

(2) 用電轉儀制造商建議的針對酵母的參數進行電轉 (表 13. 1)。

(3) 電擊后立即加人 0. 5 mL 預 冷 的 I mol/L 山梨醇和 0. 5 mL 預冷的 YPD，然后將電轉杯中所有的菌液轉移到一個 1. 5?2. 0 mL 的離心管中。

(4) 將離心管置于 30°C 緩慢搖動 (100 r/min)，培 養 3. 5?4 h。

(5) 取 1 份電轉產物涂布在選擇性瓊脂平板上，培 養 2?4 天。

(6) 為了避免混合克隆, 在進行下一步分析之前，至少需要再一次挑單克隆在選擇培養基上劃線培養以獲得單克隆。

4. 電 轉 感 受 態 畢 赤 酵 母 的 快 速 制 備

(1) 在 5 mL YPD 培養基中接種畢赤酵母，30°C 搖動培養過夜。

(2) 在 裝 有 50 mL YPD 培養基，能良好通氣的大培養瓶中，稀釋過夜培養的畢赤酵母菌液至 OD_600nm 0. 15?0. 20。

(3) 30°C 搖動培養至 OD_600nm〇.8?1. 0(4?5 h)。

(4) 室 溫 5OOg 離 心 5 min 收集菌體，棄掉上清液。

(5) 在加 有 DTT 的 9 mL 預冷 的 BEDS 溶液中重懸沉淀。

(6) 30°C 搖 動 孵 育 重 懸 液 5 m i n 。

(7) 室 溫 500 g離心 5 m i n 收 集 菌 體 ，用 I m L B E D S 重 懸 (不 含 有 D T T ) 。

(8) 按 照 上 述 電 轉 化 步 驟 進 行 電 轉 , 或 者 立 即 分 裝 細 胞 并 將 其 凍 存 在 一 80°C 。

六、重組蛋白表達菌株的鑒定

酵 母 表 達 系 統 已 經 成 功 地 用 于 重 組 蛋 白 的 大 量 制 備 ，如 I L 酵 母 培 養 液 上 清 液 中 能夠 獲 得 1? 10 g 分 泌 表 達 的 重 組 蛋 白 。但 是 ，可 能 在 初 次 嘗 試 表 達 時 不 能 夠 在 考 馬 斯 亮藍 染 色 的 凝 膠 中 看 到 目 標 蛋 白 質 的 條 帶 。因 此 ，非 常 有 必 要 在 使 用 構 建 好 的 重 組 菌 株 進行 蛋 白 質 表 達 前 ，準 備 好 一 種 或 多 種 更 為 靈 敏 的 檢 測 方 法 ?？?以 利 用 目 標 產 物 的 酶 活 性 、目 標 產 物 上 融 合 的 表 位 標 簽 或 目 標 產 物 的 特 異 性 抗 體 來 進 行 檢 測 。但 關 鍵 在 于 : 建 立 靈敏 檢 測 方 法 的 工 作 應 該 與 表 達 同 時 進 行 或 先 于 表 達 進 行 。如 下 例 所 示 ，好 的 檢 測 方 法 能夠 大 大 方 便 菌 株 的 構 建 。

檢 測 酵 母 表 達 的 外 源 蛋 白 最 便 捷 的 方 法 是 平 板 活 性 實 驗 。該 實 驗 可 以 進 行 粗 略 的 定量 。通 過 平 板 影 印 或 別 的 技 術 將 菌 落 影 印 到 另 一 個 平 板 上 ，能 夠 對 100? 1 0 0 0 個 轉 化 子的 表 達 水 平 進 行 直 接 比 較 。

圖 I3. 2 顯示了 使 用 平 板 活 性 實 驗 檢 測 分 泌 表 達 的 肌 醇 六 憐 酸 酶（phytase) 的 例 子 。這 種 酶 可 降 解 肌 醇 六 磷 酸 (phytate)，它 能 使 瓊 脂 平 板 上 表 達 該 酶 的 酵 母 克 隆 的 周 圍區域變 得 澄 清 。澄 清 區 域 的 大 小 與 肌 醇 六 磷 酸 酶 的 分 泌 量 相 關 。第 二 個 例 子 ，畢 赤 酵 母 胞 內表 達 細 菌 β-內酰胺酶 (β-lactamase)( 圖 13.3)。 通 常 畢 赤 酵 母 的 克 隆 呈 黃 色 ，表 達 斤 內 酰胺 酶 時 會 由 粉 色 轉 為 紫 色 。紫 色 的 深 度 與 酶 的 表 達 量 有 關 ，在 這 里 ，也 就 是 與 菌 株 的 表 達框 的 拷 貝 數 有 關 。最 后 指 出 ： 如 下 所 述 ，可 以 用 高 質 量 的 針 對 標 簽 區 域 或 重 組 蛋 白 自 身 的多 克 隆 抗 體 或 單 克 隆 抗 體 進 行 平 板 抗 體 實 驗 或 酵 母 印 跡 實 驗 。

轉 化 子 被 篩 選 出 來 后 ，分 離 出 單 細 胞 并 收 集 在 作 為 主 平 板 的 平 板 上 ，來 源 于 多 個 轉 化子 的 樣 品 將 被 用 于 檢 測 外 源 蛋 白 的 表 達 情 況 。在 這 之 前 ，可 以 通 過 PCR 篩 選 含 有 重 組 基因 的 轉 化 子 。如 下 所 述 ，用 玻 璃 珠 破 碎 法 在 無 細 胞 抽 提 系 統 中 提 取 出 基 因 組 D N A ，用 其作 為 模 板 ，使 用 與 重 組 基 因 兩 側 互 補 的 引 物 進 行 PC R 反 應 。根 據 使 用 何 種 啟 動 子 表 達 蛋白 (誘 導 型 的 和 組 成 型 的 ) 和 使 用 哪 種 表 達 載 體 (胞 內 的 或 分 泌 的），有 不 同 的 檢 測 方 法 用于 表 達 蛋 白 的 檢 測 。

( 1 ) 如 果 目 的 基 因 的 表 達 是 組 成 型 的 ，接 種 單 克 隆 在 YPD 培 養 基 中 ，良 好 通 氣 的 情況 下 培 養 2 ?3 天 ，在 這 段 時 間 里 可 以 用 各 種 可 行 的 檢 測 方 法 在 不 同 的 時 間 點 分 析 蛋 白 質的 表 達 。

( 2 ) 對 于 甲 醇 誘 導 型 表 達 ，首 先 在 Y PD 培 養 基 中 接 種 單 克 隆 并 培 養 17? 24 h ，然 后轉 移 到 添 加 有 甲 醇 的 新 鮮 培 養 基 中 誘 導 。誘 導 時 通 氣 要 好 , 菌 的OD_600nm在 1 0 左 右 ，在裝有 2 n iL 培 養 基 (含 有 0 . 5 % 甲 醇 ) 的 15 m L 試 管 中 進 行 。對 于 胞 內 表 達 的 蛋 白 質 ，甲醇誘 導 6? 12 h 就 足 夠 了 。

胞內表達的樣品需要制備細胞提取物后進行分析。收集培養 10?12 h 的酵母菌，使用玻璃球破碎法裂解細胞。準 備 10?50 個 OD_600nm單位的細胞, 用 150 uL 裂解緩沖液重懸 。加人等體積用無菌的酸洗過的直徑 0.45 m m 的玻璃球。最大轉速渦旋振蕩混合I m in, 然后將混合物放置冰上 I m in; 重復上述操作至少 5 次?；蛘邔⒀b有樣品的離心管放置在可以容納多個離心管的渦旋振蕩器中。將振蕩器置于 4℃；冰盒中或冷室中，以最高速振蕩大約 10 m in。在顯微鏡下檢查細胞的破碎情況，此時, 應該可以觀察到 8 〇%?9 0 % 的細胞已經破碎。細胞破碎后，將細胞碎片和緩沖液一起轉移到一個新的離心管中，另 用 100 uL 裂解緩沖液振蕩清洗玻璃球然后將洗液轉移至上述同一離心管中。 4℃高速離 心 5 m i n ，將包含目標蛋白質的上層水相轉移到新離心管中。 這 就 是 用 于 S D S -p A G E 、蛋白質印跡或酶學分析的粗提蛋白質樣品。

分 泌 蛋 白 在 培 養 基 中 積 累 很 緩 慢 ，至 少 要 培 養 2 天 才 能 達 到 高 峰 ?？?以 振 搖 誘 導 2?5 天 ，期 間 每 12 h 加 入 新 鮮 甲 醇 至 終 濃 度 為 〇 ?5 % 并 收 集 50? 100 上 清 樣 品 。上 清 樣
品 可 以 進 行 SDS-PAGE、蛋 白 質 印 跡 或 酶 學 反 應 分 析 ，也 可 以 一 20°C 凍 存 。

七、分 析 方 法 的 建 立 —酵母印 跡 法

使用抗體的各種不同分析方法有許多相似之處。酵母克隆蛋白質印跡法是一種很有
用的、酵母特異性的抗體分析方法。它有時候被稱為分泌蛋白的酵母印跡法 (「Yeastem」Blot)(圖 13. 4)。對于標準的蛋白質印跡法操作步驟，請 參 考 Sam brook 等 (1989)。

酵 母 印 跡 是 一 種 很 便 捷 的 直 接 在 平 板 上 大 量 篩 選 重 組 蛋 白 表 達 菌 株 的 方 法 。但 是 ，讀 者 應 該 明 白 ，克 隆 周 圍 光 暈 的 大 小 和 重 組 蛋 白 的 量 并 不 總 是 線 性 相 關 ，這 種 方 法 得 出 的所 有 結 果 都 應 該 用 標 準 的 蛋 白 質 印 跡 法 或 其 他 的 檢 測 方 法 加 以 驗 證 。酵 母 印 跡 法 的 操 作步 驟 如 下 所 述 。

( 1 ) 將 瓊 脂 平 板 表 面 的 新 鮮 酵 母 克 隆 用 標 準 的 平 板 影 印 法 轉 移 到 一 張 無 菌 的 Whatman No. 1 濾 紙 上 。濾 紙 應 剪 成 大 小 能 剛 好 放 進 平 板 中 。

( 2 ) 將 粘 有 酵 母 細 胞 的 濾 紙 放 在 含 有 適 量 誘 導 培 養 基 的 新 鮮 平 板 表 面 ，然 后 培 養 1?2 天 。

( 3 ) 準 備 一 張 大 小 和 上 述 濾 紙 一 樣 的 硝 酸 纖 維 素 膜 ，用 至 少 15 m L 電 轉 緩 沖 液[25mmol/L Tris(pH8.5),0.2 111 〇 1/乙甘氨酸，20% 甲 醇 將 該 膜 浸 泡 5min或更長時間。在 電 轉 緩 沖 液 中 再 浸 濕 兩 張 剪 好 的 濾 紙 。

( 4 ) 按 照 下 述 方 法 準 備 濾 紙 和 硝 酸 纖 維 素 膜 的 三 明 治 。

① 將 一 張 濾 紙 放 置 在 印 跡 裝 置 的 陽 極 (移 除 膜 之 間 的 所 有 氣 泡 是 很 有 必 要 的 ，可以用 移 液 管 在 濾 紙 表 面 滾 動 去 除 氣 泡）。

② 將 浸 濕 的 硝 酸 纖 維 素 膜 放 在 濾 紙 上 。

③ 將 影 印 有 平 板 上 酵 母 細 胞 的 濾 紙 放 在 硝 酸 纖 維 素 膜 的 上 面 。

④ 放 置 第 二 層 浸 濕 的 濾 紙 在 有 酵 母 細 胞 的 濾 紙 上 層 。

⑤ 最 后 ，將 陰 極 板 放 在 三 明 治 的 最 上 層

(5) 用恒定的電流 (1?4 mA/cm2) 作 用 I h 將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。

(6) 移走硝酸纖維素膜，將 其 在 15 m L 的 T B S 緩 沖 液 [50 m m d/L Tris-HCKpH7.6), 150m m ol/L 氯化鈉] 中洗 5 m in。之后, 將 T B S 緩沖液換成含有 1% ?5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 TBST(加 Tween-20 在 T B S 至終濃度為 0. 0 5 % ) 。置硝酸纖維素膜于封閉緩沖液中, 室溫緩慢搖動 I h 。

(7) 將濾膜轉移到 15 HiL T B S T 中室溫搖動 5 m in。

(8) 準 備 好 15 mL 封 閉 緩 沖 液 稀 釋 的 一 抗（按 照 供 貨 商 推 薦 用 量 稀 釋 ，一般為0.5 ug/mL)。

(9) 將膜和一抗在 2?8°C 緩慢搖動孵育過夜 (也可以根據所用抗體，縮短至在室溫下孵 育 1?3 h)。

(10) 用 15 mL T B S T 緩沖液至少洗膜 4 次 (每 次 5 min)，最后用新鮮 T B S T 快速沖洗 膜 。

(11) 根據供貨商推薦的用量在封閉緩沖液中稀釋酶標二抗 (一 般 在 15 m L 封閉緩沖液 中 加 3 ， 抗體)。

(12) 將稀釋的二抗和膜于室溫搖動孵育 I h 。

(13) 重復步驟 (10)。

(14) 在暗室中，根據供貨商的建議，使 用 顯 色 劑（visualization reagent) 處 理 膜（如Pierce E C L 蛋白質印跡底物），然后用濾紙移除膜上多余的液體，將膜放置在塑料的保護盒 中 ，使 用 X 射線感光膠片對整張膜曝光 30 s 至數分鐘。每個克隆周圍的信號強度和大小大致可以反映出該克隆/菌株表達分泌重組蛋白的水平。

八、重組蛋白的翻譯后修飾 (蛋白酶和糖基化）

在畢赤酵母中包括蛋白酶解和糖基化在內的翻譯后修飾會影響重組蛋白的質量。

如果最初的 SDS-P A G E 分析顯示目標蛋白質發生了降解, 那么可以嘗試畢赤酵母的蛋白酶缺陷株。較低的重組蛋白表達水平和有活性的或有免疫活性的產物小于全長產物顯示蛋白酶發生了降解。降解的蛋白質也可能在 P A G E 電泳上顯示為彌散的條帶，條帶分布在從分子質量的正常大小到較小的位置。畢赤酵母菌株 SMD1168(pep4 his4) 的大部 分 P E R 基因被刪除 (Gleeson et al.， IM S)。該基因負責活化畢赤酵母液泡中的許多蛋白酶。這些蛋白酶最初以非活性的酶原形式進入液泡，在 液 泡 中 被 P ￡T 4 產物激活。盡管分泌型的重組蛋白不會進人液泡，但是它們在培養基中會接觸到小量細胞裂解后釋放的此類蛋白酶畢赤酵母在培養時的密度非常高, 這會導致在培養基中的液泡蛋白酶濃度達到不能忽視的水平。為 了 利 用 PEP4 菌株進行表達，你要么使用你的質粒轉化SMD1168(p 印 4 his4) 或 SMD1168 H (pep4) 等菌株，要么在已經表達目標蛋白質的菌株上刪 除 基因。 為了確定缺失PEP4 對蛋白質表達是否有利，需要在平行誘導完成后對 野 生 型 和 缺 失 株 表 達 的 重 組 蛋 白 進 行 檢 測 。注意:平板上保存的 P E P 4 缺失株會更快死亡，而且不如野生型菌株容易轉化，生長得更慢，在甲醇培養基中更難誘導，尤其是 P f P4 缺失菌株很難與其他非 P E P 4 畢赤酵母菌株交配。

如 果 S DS- P A G E 顯 示 畢 赤 酵 母 中 表 達 的 重 組 蛋 白 較 預 期 的 大 ，或 者 大 小 不 一 ，那么該 蛋 白 質 可 能 被 糖 基 化 了 。你 應 該 首 先 檢 査 氨 基 酸 序 列 以 尋 找 潛 在 的 糖 基 化 位 點 :A S N -X -S e r / T h r 序 列 是 存 在 JV-糖 基 化 的 信 號 ; 任 何 S e r 或 T h r 位 點 的 一 O H 基 團 都 可 能 出 現O 糖 基 化 ?？?以 用 肽 N-糖 苷 酶 F (FPNGaSe F ，peptideN -glyc 〇 sidase F ) 處 理 可 疑 的 糖基 化 蛋 白 以 去 糖 基 化 ，然 后 通 過 S D S ^ P A G E 對 產 物 大 小 進 行 檢 測 。 從 http://www.neb.com/nebecomm/piroducts/productP0704. asp 可 以 找 到 一 個 很 好 的 蛋 白 質 去糖 基 化 的 方 法 。如 果 經 過 糖 苷 酶 處 理 后 蛋 白 質 的 分 子 質 量 變 小 ，而 且 更 為 均 一 ，那 么 幾 乎可 以 確 定 這 個 蛋 白 質 是 被 糖 基 化 了 。

九、挑 選 具 有 多 拷 貝 表 達 框 的 克 隆

在畢赤酵母表達系統中，最常用的增加重組蛋白表達量的方法或許就是增加菌株中表達框（expression cassette) 的拷貝數（Brierley，1998; Thill et al.，1990)。有兩種方法可以用來構建具有多拷貝表達框的菌株。第一種方法是構建一個擁有多個頭尾相接的表達框 (Brierley，1998) 的載體。構建這個載體的關鍵是載體的表達框的兩側有限制性內切核酸酶的酶切位點, 而且必須能夠切出互補的末端（如 Baw HI-B g m 、SaZI-X/io I 這樣的組合）。重復進行切開和插人的操作會產生一系列表達框拷貝數逐漸增多的載體。這種方案有一個獨有的優勢 (尤其在人用藥物制品方面） ，即表達框的確切數量非常清楚，而且可以通過 D N A 測序進行直接確認。

這種篩選方法的一個缺點是很難獲得足夠多的克隆用于篩選含有高拷貝表達框的菌株 。首先 ，耐高濃度藥物的轉化子數量很低，通常只占低耐藥性 (1 〇〇 ug/m L 的抗生素)轉化子數量的〇.1 % ?1. 0 % 。因此，只有在最高轉化效率的情況下，才可能會有耐高濃度藥物的轉化子出現。其 次 ，需 要 50?100 個轉化子來篩選高拷貝菌株，這是因為在顯示高耐藥性的轉化子中，只 有 1 % ?5 % 是由于細胞內具有多拷貝的表達框，更多的菌株的耐藥性來自于其他未知因素。

在某種程度上，由于通過直接篩選獲得多拷貝菌株有一定的難度，人們發展了另外一
種獲得高拷貝和高重組蛋白表達水平的菌株的方法 (Sunga et al., 2008)。 簡單地說, 使用更高藥物濃度從在較低藥物濃度水平篩選出來的只具有一個或幾個表達框拷貝的畢赤酵母轉化子中篩選獲得具有更高拷貝表達框的菌株, 也就是在逐漸提高濃度的抗生素平板上劃線來進行篩選。例如，在 100 ug/m L 的抗生素平板上篩選獲得最初的轉化子，接下來將這些轉化子在含有 500 ug/mL 的抗生素平板上劃線。收集在較高抗生素濃度下能夠生長的克隆作為單個菌 株 ，然后確認這些菌株中的一個或多個具有升高的重組蛋白表達水平以及通過 P C R 確認高耐藥性的獲得緣于含有較多拷貝的載體。一旦某個菌株被確認為是更高表達水平/更多拷貝數的菌株，就重復之前的步驟繼續用更高的抗生素濃度 (2 mg/mL) 進行篩選。再 一 次獲得更高耐藥性的菌株并檢測重組蛋白的表達量和載體拷貝數。這 種反復篩選的過程稱為轉化后載體擴增法 （p 〇 sttransformationa[ vectoramplification,PTV A)。利用這個方法可以獲得具有多個頭尾相接載體拷貝的菌株, 這些載體通常整合進基因組的單一位點。對 P T V A 法篩選得到的克隆的分析顯示，它們中有4 0 % 的載體拷貝數有 3?5 倍的增加。被稱為「頭獎」(jackpot) 的那些克隆具有 10 個以上的表達載體的拷貝，它們占所篩選出的克隆的 5 % ?6 % , 某些克隆的重組蛋白的產量具有相應比例的提高。

盡管這種載體拷貝數擴增過程的分子機制仍然不清楚, 但對該過程已經有了一些關
鍵發現。首先，這種擴增能夠在含有任何一種載體的菌株中小比例自然地發生。其 次 ，PTVA 過程導致了整個載體的擴增，而不僅僅是擴增載體的一部分, 如耐藥基因。顯而易見 ，這點在需要獲得均一重組蛋白產物時非常重要。再次，D N A 印跡數據表明，所有的拷貝都像原始拷貝一樣，在相同的位置插入到畢赤酵母基因組中，且以首尾相連的構象存在。

最后指出的是，PTVA 法對具有其他藥物抗性篩選標記的載體同樣有效。并不僅限
于抗生素載體。因 此 , 這個擴增過程似乎是該種酵母菌對高藥物濃度的一個通常的反應?？紤]到其他品種的酵母菌也有類似的同源重組系統，這個技術也應該適用于其他種類的酵母菌。