線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞 (MCAO) 模型

腦血管疾病是人類發病率最高的疾病之一，模擬臨床疾病，制作較為可靠的腦缺血動物模型顯得尤為重要。根據實驗目的不同，可以制備全腦缺血模型和局灶性腦缺血模型。大腦中動脈(MCA)是人群腦卒中的多發部位，MCA閉塞模型(MCAO)被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型，制作方法主要有以下幾種：開顱結扎法(Tamura等采用頗下部開顱，分離近端MCA,電凝或用手術絲線結扎MCA,造成腦梗死，是目前公認的標準MCAO)、光化學法(Watson等首次建立了光化學法誘導腦皮層梗死的動物模型，即采用立體定位儀固定大鼠頭部，暴露顱骨，尾靜脈注射光敏材料熒光素Rose Bengal,用560nm波長的特定光源照射局部頭顱，光線透過顱骨與血管內的染料接觸，激發光化學反應，引起照射部位皮層血管內皮細胞毒性腦水腫而導致腦梗死）、栓塞法(Kudo等采用<100μ,m的同源血凝塊栓子懸液，注入頸總動脈CCA,在頸外動脈ECA的頸內動脈ICA開口處置一可逆性插管，栓子則由ICA進入MCA,導致同側大腦皮層、海馬、深層灰質結構的梗死；也有人用碳素顆粒、花生四烯酸鈉作為栓塞劑制成腦梗死模型），以及我們要詳細介紹的線栓法。線栓法用于制作局灶性腦缺血模型的實驗研究，其基本原理是用線栓阻閉大腦中動脈起始部，造成大腦中動脈供血區缺血，從而使大鼠發生局灶性腦缺血。此方法的特點是穩定性好、重復性好、損傷小、梗死部位確切和成功率高。

1.制備線栓，選擇3-0的尼龍線27mm,頭端用酒精燈加熱成直徑為0.33mm的半球形，并用硅膠脂涂抹。

2.250-300g大鼠，2%戊巴比妥鈉每千克體重40-60mg腹腔注射麻醉。

3.動物麻醉后仰臥固定于手術臺上，用肛溫探頭測定大鼠肛溫，取肩腫連線以上正中切口，用血管鉗垂直鈍性分離甲狀腺連接部，暴露頸部肌群。

4.鈍性分離由二腹肌，胸鎖乳突肌和肩脾舌骨肌組成的肌間隙，暴露右側頸總動脈和迷走神經，再逐步暴露頸總動脈分叉，頸外動脈和頸內動脈。

5.然后用3-0的手術線結扎頸外動脈遠心端和頸總動脈近心端，并用手術線緊拉頸內動脈使與頸總動脈成一條直線。

6.通過Longa評分法或者Garcia評分法，以及腦梗死容積的測定，來篩選和判斷模型制作是否成功。

Longa評分法： 6級評分法

①0級無功能障礙；②1級不能伸展左側前肢；③2級向左側旋轉；④3級向左側傾倒；⑤4級無自主活動伴意識抑制；⑥5級死亡。初步評定模型的成功與否，將評分在1-3級的動物納入下一步實驗，其余動物予以排除。

Garcia評分法：

Garcia評分法最低為3分，最高為18分，得分越高表明動物的神經行為學狀況越好。其中前4項評價動物的運動功能，后2項評價動物的感覺功能。3-7分為重度神經功能障礙，8-12分為中度神經功能障礙，13-16分為輕度神經功能障礙（表4-3片將評分在7-13分的動物納入下一步實驗，其余動物予以排除。

7.腦梗死容積的測定：

用TTC染色來確定腦梗死容積。

(1)斷頭處死動物，迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10min。

(2)于腦槽中取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，迅速放入2% 2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)溶液(37℃)中染色30min,然后用4%多聚甲酸固定。

(3)24h后用數碼相機拍照，輸入計算機，用圖像處理軟件(ADOBE,PHOTOSHOP)計算梗死面積，粉紅色區為正常腦組織，白色區為梗死區。

(4)為減少腦缺血半球水腫對結果帶來的影響，梗死容積采用損傷對側正常組織容積減去同側正常組織容積的辦法來計算，結果用梗死容積百分比表示。梗死容積百分比＝（對側正常組織容積－同側正常組織的容積）／對側正常組織容積X100%。

1.在尼龍線的選擇方面，可供選擇的有3-0和4-0等規格，動物體重在250-300g時，選擇3-0的尼龍線。

2.小鼠程序同大鼠，所選動物體重范圍20-25g,線栓用6-0,線栓頭0.1mm左右，深度9mm左右。

3以下二條，有一條滿足應將實驗動物剔除：

① 手術過程中出血過多，3h未蘇醒者應剔除；②Longa評分法是0分，或Garcia評分在0-6，14-18分的大鼠應當剔除；③顱底出血的動物也應剔除（判斷顱底出血的方法是將大鼠大腦取出后觀察大腦中動脈起始部有沒有出血塊）。

1動物麻醉對手術后死亡率有很大的影響，麻醉藥最好現用現配，未用完的麻醉藥最好4℃保存。

2.手術過程中分離血管時動作要輕柔，以免對迷走神經造成損傷。牽拉血管時應將頸內動脈和頸總動脈擺成一條直線，這樣可以減少放線栓時插入翼鄂動脈的概率。

3.在插入線栓時，感覺到有阻力時用鑷子尖部輕輕推一兩下，但不能用力過大。這樣既可以保證模型的成功率也可以減少顱腔內出血的可能。

4.手術完成后結扎頸內動脈時一定要注意扎緊，以免線栓拖出。